PCR & qPCR Thermocycler
Entdecken Sie unsere große Produktvielfalt an leistungsstarken PCR- sowie hocheffizienten Real-Time-PCR-Thermocyclern für die Amplifikation und Quantifizierung von Nukleinsäuren.
Unsere PCR- und Real-Time PCR-Thermocycler sind auch als vollautomatische Systeme für vollautomatisierte Workflows erhältlich.
Über die gesamte Nutzungsdauer Ihrer Geräte unterstützen wir Sie mit unseren Dienstleistungen rund um Applikationsberatung, Temperaturkalibrierung, Wartung und Qualifizierungs-Services.
PCR und qPCR erklärt
Spätestens seit der Corona-Pandemie ist die Abkürzung “PCR” in aller Munde. PCR steht für Polymerase Chain Reaction, zu Deutsch Polymerase-Kettenreaktion. Die PCR ist heute eine Standardmethode zum Nachweis von Nukleinsäuren – vor allem DNA oder RNA – in Proben verschiedenster Ausgangsmaterialien. Dazu werden spezifische Bereiche der Nukleinsäuren durch stetiges Erhitzen und wieder Abkühlen vervielfältigt. Die Methode ist hoch sensitiv und kann winzigste Mengen an Erbgut nachweisen. Die PCR wurde seit ihrer Entwicklung in den 1970er und 1980er Jahren immer weiter verbessert. Die Real-time PCR etwa kann heute den Fortschritt der Vervielfältigung in Echtzeit anzeigen und die quantitative Real-time PCR, qPCR genannt, sogar die Konzentration der vervielfältigten DNA oder RNA bestimmen.
Nukleinsäuren und ihre Unterschiede
Unter Nukleinsäuren versteht man allgemein das Erbgut aller Organismen – von Tieren, Pflanzen, Pilzen, Bakterien oder Viren. Es sind Makromoleküle bestehend aus den Nukleotiden, die sich aus je einer Phosphatgruppe, einem Zuckermolekül und einer Base zusammensetzen. Nukleotide sind die Hauptbausteine der Nukleinsäuren Desoxyribonukleinsäure, kurz DNS oder DNA genannt, und der Ribonukleinsäure, kurz RNA. Die Unterschiede zwischen diesen Nukleinsäuren bestehen vor allem in der Art des Zuckermoleküls, in den organischen Basen sowie in der molekularen Struktur. Beide verwenden eine Pentose – ein Zuckermolekül mit fünf Kohlenstoffatomen –, die sogenannte Ribose. Die Ribose der DNA besitzt jedoch am zweiten Kohlenstoffatom lediglich ein Wasserstoffatom, während die RNA an dieser Stelle eine Hydroxygruppe (Wasserstoff-Sauerstoff-Gruppe) aufweist. Dieser kleine Unterschied hat erhebliche Auswirkungen auf die Stabilität der DNA- und RNA-Stränge. Die RNA ist dadurch leichter spaltbar. RNA nutzt zudem die Base Uracil anstelle der Base Thymin, wie bei der DNA. Der offensichtlichste Unterschied besteht jedoch in der Struktur des Moleküls. Die DNA ist eine Doppelhelix, ein gewundener Doppelstrang. Die RNA ist dagegen ein Einzelstrang. Die Doppelhelix-Struktur der DNA wird durch eine komplementäre Basenpaarung von Guanin mit Cytosin und Adenin mit Thymin hervorgerufen. Die Basen der RNA können zwar auch untereinander Bindungen eingehen, jedoch kommt dies eher selten vor. RNA ist aufgrund seiner variableren Struktur chemisch reaktiver und kann mehr Bindungen mit anderen Molekülen eingehen.
Bei der Proteinbiosynthese spielen beide Nukleinsäuren eine wichtige Rolle. Die DNA speichert die Erbinformationen als Code über die verschiedenen Kombinationen ihrer Basenpaare. Durch Replikation werden diese Informationen vervielfältigt und an neue Zellen weitergegeben. Die Informationen der DNA dienen als Vorlage und werden in eine RNA-Sequenz übertragen (Transkription), die anschließend in den Ribosomen die Herstellung von Proteinen anstößt (Translation). Diesen Typ von RNA nennt man messenger RNA (mRNA) oder Boten-RNA. Es gibt noch weitere RNA-Typen, die unterschiedliche Funktionen in der Zelle wahrnehmen, jedoch keine Erbinformationen codieren. Es gibt zudem RNA-Viren, deren gesamtes Erbgut aus einem RNA-Strang besteht.
Warum Nukleinsäuren via PCR nachgewiesen werden
Die Erbinformationen sind der genetische Fingerabdruck eines jeden Organismus. Mit der PCR lässt sich dieser Fingerabdruck eindeutig nachweisen. Dabei können geringste Spuren oder auch nur Fragmente von DNA und RNA aufgespürt werden. Damit ist die PCR eine effektive Methode um etwa Viren, Bakterien oder Erbkrankheiten zu diagnostizieren. Auch in der Genealogie oder der Gerichtsmedizin findet die Methode Anwendung, etwa bei Abstammungsgutachten oder um Täter-DNA zu identifizieren. Auch bei Herkunfts- und Inhaltsanalysen von Lebens- und Genussmitteln kommt die PCR zum Einsatz, , beispielsweise beim Nachweis von Allergenen. Auch können pflanzliche oder tierische Zutaten oft unterschiedliche genetische Informationen in unterschiedlichen Regionen aufweisen. DNA wird zudem auch industriell vervielfältigt, um aus ihr Proteine für Medikamente oder andere medizinische Anwendungen zu gewinnen. Dies erfolgt häufig ebenfalls über PCR-Applikationen.
PCR und qPCR – Amplifikation und Quantifizierung
Die Methodik der PCR beruht grundlegend auf der natürlichen Replikation, also der Vervielfältigung des Erbguts in Zellen. Mit Hilfe von Thermocyclern wird dieser Vorgang künstlich nachgestellt. Die PCR vervielfältigt eine genau definierte Gen-Sequenz durch systematisches Erhitzen und Abkühlen. Dieser Prozess wird Amplifikation genannt. Die DNA wird in einem ersten Schritt zum Beispiel bis auf 95°C erhitzt und dadurch denaturiert, d.h. die Bindungen zwischen den Doppelsträngen lösen sich auf und sie zerfällt in Einzelstränge. Danach folgt die Primerbindung (Annealing). Die Primer docken sich hierbei an beiden Seiten der Gen-Sequenz an. Sie legen damit das zu vervielfältigende DNA-Teilstück fest. Die Temperatur wird dazu auf 55 bis 65°C heruntergefahren. Nun folgt bei einer Temperatur um 70°C die Elongationsphase, in welcher die Einzelstränge zu einem spezifischen DNA-Doppelstrang synthetisiert werden. Der Vorgang wird so lange wiederholt, bis eine ausreichende Menge des gewünschten DNA-Abschnittes für eine Bestimmung hergestellt ist. Zum Nachweis von RNA nutzen Labore die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). Hierbei wird die Ziel-RNA zunächst in eine komplementäre DNA-Sequenz umgeschrieben und danach amplifiziert.
Die quantitative Real-time PCR (qPCR) ist eine Weiterentwicklung des PCR-Verfahrens. Während mit der klassischen PCR nach der Amplifikation lediglich Aussagen getroffen werden können, ob eine bestimmte Gen-Sequenz amplifiziert wurde oder nicht, wird mit der qPCR nach jedem Amplifikationszyklus geprüft, welche Menge an amplifizierter DNA vorhanden ist. So kann auch der Verlauf der Amplifikation in Echtzeit analysiert werden. Hierzu wird gewöhnlich ein Fluoreszenzverfahren genutzt. Ein spezielles, fluoreszierendes Färbemittel lagert sich dabei an den DNA-Strängen an. Moderne qPCR-Thermocycler wie der qTOWER³ von Analytik Jena nutzen für die Quantifizierung des Farbstoffes einen zusätzlichen Detektor, um die Fluoreszenz und damit den Verlauf der Amplifikationszyklen zu messen.
qPCR-Applikationen
Analog zur Standard-PCR kann die qPCR ebenfalls für die Diagnostik von Pathogenen, in der Lebensmittelüberwachung, der Gerichtsmedizin oder der Pharma-Produktion eingesetzt werden. Dank ihrer Quantifizierungsfunktion erschließen sich jedoch noch viele weitere Anwendungsfelder, darunter viele junge Forschungsdisziplinen. Die qPCR kann beispielsweise für die Quantifizierung der Genexpression – wie ein bestimmtes Gen in Erscheinung tritt – angewendet werden. Standard-PCR-Verfahren sind dafür zu unzuverlässig.
Auch im Next Generation Sequencing (NGS) finden qPCR-Thermocycler Anwendung. NGS ist ein Sammelbegriff für neue, sehr schnelle Verfahren zur Sequenzierung von Erbgut. In vielen Bereichen der NGS spielt die Quantifizierung von DNA und RNA eine wichtige Rolle. Quantitative PCR wird etwa für diverse NGS-Vorbereitungsschritte verwendet, zum Beispiel zur Erstellung von DNA-Bibliotheken (Library Preperation). Die qPCR ermöglicht darüber hinaus die Quantifizierung und die Genotypisierung (Genotyping), also die Charakterisierung zum Beispiel eines Viren-Stammes in der klinischen Diagnostik. Viele Viren gelangen häufig durch indirekte Infektionen oder Ko-Infektionen in den menschlichen Körper, was zu Fehldiagnosen führen kann. Die Anzahl von Viruskopien kann, etwa bei bestimmten Herpesviren, Auskunft darüber geben, ob ein bisher inaktives Virus ausgebrochen ist. Die Quantifizierung über qPCR-Verfahren schafft hier eine solidere Datenbasis für Diagnosen und Behandlungsfortschritte.
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