Real-time Thermocycler (qPCR)
Mit den Real-Time PCR-Thermocyclern der qTOWER³-Serie erhalten Sie die schnellsten und zuverlässigsten Real-Time PCR Ergebnisse für Ihre Anwendung.
Neben Geräten für Ihren Labortisch umfasst unser Real-time PCR-Portfolio auch vollautomatische Thermocycler zur Integration in robotisierte Workflows.
Thermocycler für Real-time PCR / qPCR
Die Real-time PCR und quantitative Real-time PCR (qPCR) sind Weiterentwicklungen der klassischen PCR, mit deren Hilfe die Amplifikationszyklen der Ziel-DNA in Echtzeit überwacht und analysiert werden können sowie deren Konzentration bestimmt werden kann. Thermocycler für Real-time PCR / qPCR zählen heute zu den Standardinstrumenten in nahezu allen molekularbiologischen Laboren der Welt. Die qPCR-Thermocycler der qTOWER³-Serie von Analytik Jena gehören zu den leistungsstärksten und zuverlässigsten Geräten auf dem Markt.
Besonderheiten der Real-time PCR / qPCR
Die Methode der Real-time PCR dient dem qualitativen Nachweis von bestimmten Nukleinsäuren in einer Probe. Wird eine Nukleinsäure zusätzlich quantitativ nachgewiesen, also deren Konzentration bestimmt, spricht man auch von quantitativer Real-time PCR bzw. qPCR. Die grundlegende Methodik der PCR findet auch bei der Real-time PCR / qPCR Anwendung. In drei wesentlichen Schritten – Denaturierung, Annealing und Elongation –, die sich mehrfach wiederholen, werden Nukleinsäuren wie DNA oder RNA-Transkripte amplifiziert. Im Unterschied zur Standard PCR ermöglicht die Real-time PCR / qPCR es jedoch, die Amplifikation in Echtzeit zu überwachen und das Produkt zu quantifizieren.
Dazu werden häufig spezielle dsDNA-Fluoreszenzmarker eingesetzt, die sich an die Nukleinsäuren binden – zum Beispiel SYBR Green I. Mit Hilfe der Fluoreszenz lassen sich die zu amplifizierenden Nukleinsäuren nach jedem Zyklus quantifizieren. Je größer die Menge der replizierten DNA, umso höher die Fluoreszenz. Das Fluoreszenzsignal nimmt also proportional zur Menge der DNA zu.
Eine andere Methode zur Quantifizierung und Echtzeit-Analyse ist die Real-time PCR / qPCR mit Fluoreszenz-Sonden. Hierbei kann zwischen Hydrolyse- und Hybridisierungs-Sonden unterschieden werden. Bei den Hydrolysesonden, auch TaqMan-Sonden genannt, wird ein Reporter-Farbstoff mit einer Lichtquelle angeregt. Das daraufhin ausgegebene Licht wird zunächst durch einen weiteren Farbstoff gelöscht und nur bei der erfolgreichen Amplifizierung der DNA (bei der Hydrolyse der Sonde) ausgestrahlt und kann gemessen werden. Hybridisierungs-Sonden, sogenannte FRET-Sonden, nutzen das physikalische Prinzip des Förster-Resonanzenergietransfers: Hier wird die Energie eines durch eine Lichtquelle angeregten Farbstoffs (Donor) auf einen zweiten Farbstoff (Akzeptor) übertragen. Vergrößert sich der Abstand zwischen Donor und Akzeptor, verringert sich das Fluoreszenzsignal des Akzeptors. Das entsprechende Signal des Donors steigt an. Sowohl TaqMan- als auch FRET-Sonden werden aufgrund ihrer hohen Spezifität bevorzugt in der Diagnostik eingesetzt.
Um schließlich Aussagen zur Quantifizierung treffen zu können, wird der Ct-Wert (cycle threshold) herangezogen. Dieser gibt an, wie viele Zyklen der Real-time PCR / qPCR notwendig sind, um einen vordefinierten Grenzwert des Messsignals zu überschreiten. Enthält die Probe vor der Amplifikation bereits eine größere Menge an Ziel-DNA, sind weniger Zyklen notwendig als bei geringeren Mengen. Aus dem Ct-Wert lassen sich Rückschlüsse auf die Ursprungsmenge der zu amplifizierenden DNA in der Probe ziehen und damit beispielweise Aussagen über eine bestimmte Viruslast treffen.
Aufbau von Thermocyclern für Real-time PCR / qPCR
Bei (q)PCR-Thermocyclern ist das Hauptbauelement der Heizblock. Das gleichmäßige Erhitzen und Abkühlen der Proben ist ein essenzieller Schritt im Prozess der Amplifikation. Das Grundprinzip ist der Peltier-Effekt, der den schnellen Wechsel von Heizen und Abkühlen durch die Umkehr der Stromrichtung zwischen zwei Halbleitern hervorruft. Vor allem beim Material unterscheiden sich die Heizblöcke von Thermocyclern für Real-time PCR / qPCR zum Teil deutlich. Die meisten Geräte verwenden einen Aluminiumblock mit einer speziellen Legierung. Moderne qPCR-Thermocycler, wie etwa die Geräte der qTOWER³-Serie von Analytik Jena, verwenden verbesserte Heizblocktechnologien. Der qTOWER³ beispielsweise setzt auf Silberblöcke mit einer Goldbeschichtung. Dank dieser Innovation sind wesentlich schnellere Heiz- und Kühlraten möglich. Gradientenfunktionen für das exakte Skalieren verschiedener Temperaturen innerhalb eines Probenblocks finden sich ebenso in vielen neueren qPCR-Thermocyclern.
Für die Echtzeit-Überwachung und Quantifizierung verfügen Real-time PCR- bzw. qPCR-Thermocycler zusätzlich über optische Komponenten zur Fluoreszenzanregung- und Messung. Gewöhnlich regt eine Lichtquelle die Fluoreszenzfarbstoffe in der Probe an. Auch Multiplex-Anwendungen mit mehreren fluoreszierenden Farbstoffen sind mit besonders leistungsstarken Geräten möglich.
In den letzten Jahren haben zwei Aspekte des Designs von Thermocyclern immer mehr Bedeutung gewonnen: Die Automatisierung und die Software. Labore sehen sich mit einer stetig wachsenden Anzahl von Proben konfrontiert, haben jedoch selten mehr personelle oder zeitliche Ressourcen zur Verfügung. Der Schlüssel liegt in der Automatisierung von Analyseprozessen im Labor. Robotisierte Systeme zum Pipettieren, Labeln und Transport – um nur einige zu nennen – finden sich heute selbst in den kleinsten Laboren. Auch die Designs der Thermocycler müssen dieser Entwicklung Rechnung tragen, d.h. sich einfach in diese automatisierten Setups integrieren können und Schnittstellen zu anderen Geräten im Prozess bieten. Unmittelbar damit verknüpft ist der zweite Aspekt. Aufgrund des Automatisierungstrends muss die Software eines qPCR-Thermocyclers heute sehr flexibel gestaltet sein, um mit verschiedenen Laboranwendungen und -geräten kommunizieren zu können. Darüber hinaus haben sich die Ansprüche des Laborpersonals an die Software stark verändert. Heute werden grafische Nutzeroberflächen, einfache Modellierungen von Prozessen und intuitive Nutzerführung verlangt, um effizienter arbeiten zu können und auch ungeschultes oder fachfremdes Personal schnell mit den Geräten vertraut zu machen.
Zielindustrien und Applikationen von qPCR-Thermocyclern
Thermocycler für die Real-time PCR / qPCR haben heute vielfältigste Applikationsfelder. PCR bzw. Real-time PCR / qPCR ist in der breiten Öffentlichkeit vor allem für diagnostische Anwendungen bekannt. Der Nachweis von Krankheitserregern in verschiedensten Probenmaterialien ist allerdings nur eines von vielen Gebieten, in denen die PCR und qPCR angewendet wird. Die Zielindustrien reichen dabei von Pharma und Chemie bis hin zur Lebensmittelindustrie und Umweltanalytik. Real-time PCR-Thermocycler sind zudem in der universitären und institutionellen Forschung weit verbreitet.
qPCR-Thermocycler werden darüber hinaus beispielsweise für die Produktion von Proteinen oder für die Erforschung der Eigenschaften bestimmter Proteine in der Pharma-Industrie genutzt. Auch in der Lebensmittelindustrie und Landwirtschaft existieren zahlreiche Applikationen. So wird die Real-time PCR / qPCR etwa für die Spezies- und Herkunftsanalyse bestimmter Lebensmittel oder für den Nachweis von genetisch veränderten Organismen (GMO) genutzt. Ein weiteres Feld, das in der jüngsten Vergangenheit mehr und mehr auf die qPCR setzt, ist die Umweltanalytik. Neben dem bereits seit langem etabliertem Nachweisen von chemischen Elementen oder Summenparametern spielen Untersuchen von Pathogenen in Gewässern oder Böden eine immer größere Rolle. Die abwasserbasierte Epidemiologie ist in diesem Zusammenhang besonders hervorzuheben. Durch die Corona-Pandemie hat diese Disziplin in den letzten Jahren sehr viel Aufmerksamkeit erhalten. Durch die gezielte Untersuchung von Abwässern auf bakterielle oder virale Erreger lassen sich flächendeckende Krankheitsausbrüche voraussehen, was den Behörden und anderen Institutionen der öffentlichen Gesundheit sehr viel früher Hinweise auf mögliche Gefahrenlagen gibt. Während der Corona-Pandemie konnte die Effizienz dieses Frühwarnsystems bereits in Testversuchen demonstriert werden. Die Real-time PCR / qPCR spielt dabei eine wesentliche Rolle. Proben aus Kläranlagen können mit ihr in kürzester Zeit analysiert werden. Das ist nicht nur für die frühzeitige Identifikation von Coronavirus-Hotspots interessant, sondern auch für das großflächige Monitoring anderer biologischer Parameter, wie zum Beispiel E.coli-Bakterien. Analytik Jena ist ein Pionier in diesem Gebiet und unterstützt zahlreiche Kunden weltweit bei der Etablierung entsprechender Frühwarnsysteme mit Know-how und technologischen Lösungen.
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