Western Blotting

Entdecken Sie unser umfassendes Angebot an Western-Blotting-Lösungen für den optimalen Transfer von Proteinen und Nukleinsäuren von Elektrophorese-Gelen auf Trägermembranen.

Western Blotting

Das Western Blotting bezeichnet eine weit verbreitete Routinetechnik für die Proteinanalyse. Das Verfahren ermöglicht die Identifizierung bestimmter Proteine aus einer komplexen Proteinmischung, indem diese auf eine Trägermembran übertragen werden (Blotting). Die Proteine werden zunächst per Gelelektrophorese in Proteinbanden aufgetrennt und mittels elektrischem Feld auf eine Trägermatrix übertragen, wo sie entsprechend ihrer Eigenschaften binden und mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden können.

Das Western Blotting ist in der pharmazeutischen, biochemischen und medizinischen Forschung sowie bei der Diagnostik von Virusinfektionen fest etabliert. Als eines der meistverwendeten proteinanalytischen Methoden punktet das Verfahren durch eine einfache, kostengünstige und hochspezifische Identifizierung von Proteinen.

Der Western Blot - Begriffsherkunft und Geschichte

Bei dem Begriff Western Blotting (Blotting = Übertragung) handelt es sich um ein Namensspiel in Anlehnung an den sogenannten Southern Blot: Dabei handelt es sich um ein ähnliches Verfahren zum Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen, das von Ed Southern etabliert wurde. 

Neben dem Western Blot hat sich im Sprachgebrauch auch der Northern Blot verankert, der die entsprechende Auftrennung von RNA-Fragmenten beschreibt. Die folgende Übersicht zeigt namensähnliche Blotting-Methoden, die jeweils unterschiedliche molekularbiologische Analyseverfahren beschreiben:

• Southern Blot: Ein von Ed Southern etabliertes Verfahren zur Auftrennung von DNA-Fragmenten mit nachfolgender Hybridisierung
• Northern Blot: Das Pendant zum Southern Blot zur Auftrennung von RNA-Fragmenten.
• Western Blot: Die Übertragung von Proteinen auf eine Trägermembran als proteinanalytisches Verfahren
• Far-Western-Blot: Ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen
• SouthwesternBlot: Ein Verfahren zum Nachweis von DNA-Protein-Reaktionen
• Northwestern Blot: Eine Methode zum Nachweis von RNA-Protein-Reaktionen

Der Begriff Western Blot wurde im Jahr 1981 von W.Neal Burnette geprägt, obschon die Methode bereits zwei Jahre vorher von Wissenschaftlern an der Stanford University und dem Friedrich Miescher Institut in Basel unabhängig voneinander entdeckt wurde.

Heute zählt das Verfahren zu den meist verwendeten Routinetechniken für die Proteinanalyse und wird sowohl für die qualitative als auch für die semi-quantitative Analyse eingesetzt.

Das Blotting-Prinzip und die Proteindetektion

Das Prinzip des Western Blottings basiert darauf, das zu analysierende Proteingemisch auf einer Trägermatrix aufzubringen, nachdem die Proteine über eine Gelelektrophorese anhand ihrer Eigenschaften wie Ladung und Größe als Proteinbanden getrennt wurden, . Durch diese Vorgehensweise sind die Proteine dann für den Nachweis mithilfe von Antikörpern zugänglich. Die drei wesentlichen Schritte – Gelelektrophorese, Blotting und Detektion – werden im Folgenden detailliert erläutert.

Beim Transfer der Proteine behalten diese ihre im Gel eingenommene elektrophoretische Auftrennung bei und liegen nun in aufgetrennter Form auf der Trägermatrix vor. Sie sind dadurch für Detektionsmethoden zugänglich.

Schritt 3: Detektion

Um die Proteine auf der Trägermatrix im Anschluss nachzuweisen, werden meist Antikörper verwendet, die sich an ein bestimmtes Protein binden. So gelingt es, beispielsweise Virusproteine zu identifizieren und dadurch Infektionen nachzuweisen.

Vor der Detektion der Proteine müssen Wechselwirkungen zwischen der Membran und dem zum Nachweis verwendeten Antikörper verhindert werden. Dazu wird die Membran in eine verdünnte Proteinlösung gegeben, dabei kann es sich beispielsweise um 3 - 5 % Rinderserumalbumin (BSA) oder fettfreie Trockenmilch handeln. Die Lösung bindet die Membran an den Stellen, an denen sich die Zielproteine nicht angelagert haben – in der Folge können sich die Antikörper ausschließlich am spezifischen Zielprotein binden, was zu einem besseren Analyseresultat führt.

Das Zielprotein kann im Anschluss durch eine Farbreaktion identifiziert werden. Dabei werden zwei verschiedene Antikörper auf die Membran aufgetragen. Im ersten Schritt bindet sich der Primärantikörper am Zielprotein. Im Anschluss werden unspezifisch bindende Antikörper aus der Membran gewaschen, bevor der Sekundärantikörper aufgetragen wird. Dieser dockt am sogenannten Fc-Fragment des Primärantikörpers an und katalysiert bei der Zugabe eines entsprechenden Substrats eine Farbreaktion. Die Beobachtung der Farbreaktion erlaubt schließlich den Nachweis eines spezifischen Antikörpers.

Anwendungsgebiete des Western Blottings

Das Western Blotting hat sich in der pharmazeutischen und medizinischen Analyse als zuverlässige Methode zur Identifizierung bestimmter Proteine in einer komplexen Proteinmischung etabliert. Das Verfahren erlaubt nicht nur den qualitativen Nachweis eines Proteins, sondern auch die semi-quantitative Schätzung auf der Basis der Größe und Farbintensität der Proteinbande.

In der Proteinbiochemie wird das Western Blotting für die Identifizierung von Proteinen oder Protein-Veränderungen eingesetzt, es eignet sich beispielsweise für den Nachweis von posttranslationalen Modifikationen an Proteinen. In der Medizin hat sich das Western Blotting als Diagnoseverfahren für verschiedene Infektionskrankheiten bewährt. So erlaubt die Methode beispielsweise den Nachweis von Antikörpern im Blutserum, etwa beim HIV-Test. In der Krebsforschung erlaubt der Western Blot die Bewertung von Medikamenten, indem deren Wirkung auf das Wachstum von Tumorzellen mittels der Quantifizierung von ERK-Proteinen nachgewiesen wird.

Häufig wird das Western Blotting auch in Kombination mit weiteren Methoden für den Nachweis von Proteinen eingesetzt. So dient es beispielsweise als Bestätigungstest für einen positiven ELISA-Suchtest in der HIV-Diagnostik.