Elektrophorese und Blotting

Wir bieten Ihnen ein umfassendes Sortiment an Gelelektrophorese-Systemen unserer Biometra-Produktfamilie. Der Abschnitt Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) beinhaltet diverse Systeme für die Auftrennung von Proteinen in vertikalen Elektrophorese-Systemen und zugehörige Methoden.

Für die Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA und Nukleinsäuren werden unterschiedliche horizontale Elektrophorese-Systeme angeboten. Adäquate Power Supplies für den Niederspannungs-Bereich stehen für elektrophoretische Auftrennungen und Blotting-Applikationen zur Verfügung. Im Kapitel Blotting werden diverse Apparaturen für den Transfer von Proteinen und Nukleinsäuren aus Polyacrylamid-Gelen, Agarose-Gelen oder Lösungen auf Trägermembranen (Blottingmembranen) präsentiert. Semidry-Blotter und Tank-Blotter stehen hier für unterschiedlichste Anwendungen zur Verfügung.

Elektrophorese und Blotting

Bei den Verfahren Elektrophorese und Blotting handelt es sich um zwei häufig kombinierte Methoden der Molekularbiologie. Die Kombination aus beiden Verfahren erlaubt die Separation bestimmter Moleküle aus einem Gemisch (Elektrophorese) sowie die anschließende Übertragung (Blotting) auf eine Membran. Bei der abschließenden Detektion kann der Blot-Membran ein Antikörper oder eine radioaktiv markierte Sonde hinzugefügt werden, um ein gesuchtes Molekül zu identifizieren. Dadurch gelingt es, eine Probe zuverlässig auf Nukleinsäuren oder bestimmte Proteine zu untersuchen.

Die Verfahrenskombination aus Elektrophorese und Blotting gehört heute zu den gängigen Verfahren der Molekularanalytik. Zu den typischen Anwendungszwecken gehören beispielsweise der Nachweis von Antikörpern im Blutserum als Diagnosemethoden für bestimmte Infektionskrankheiten oder der Nachweis von Gensequenzen in einem DNA-Gemisch. Die Anwendungsfälle reichen von der Pharmazie über die Biochemie bis zur medizinischen Diagnostik und Forschung.

Ursprung und Geschichte von Elektrophorese und Blotting

Der Begriff der Elektrophorese beschreibt die räumliche Trennung geladener Moleküle beziehungsweise Molekülgruppen in einem elektrischen Feld. Bereits im frühen 19. Jahrhundert gelang es den Wissenschaftlern Pjotr Iwanowitsch Strachow und Ferdinand Friedrich von Reuß, das Phänomen der Elektrophorese nachzuweisen. Bis die Elektrophorese als molekularbiologisches Verfahren genutzt werden konnte, sollte allerdings noch einige Zeit vergehen: Im Jahr 1937 entwickelte der schwedische Chemiker Arne Tiselius eine Methode zur Trennung von Kolloiden in einer Trägerflüssigkeit mittels elektrischem Feld. Mit dieser Arbeit legte er den Grundstein für die Elektrophorese und sicherte sich gleichzeitig den Nobelpreis für Chemie, der Tiselius 1948 verliehen wurde. Bereits in den 1940er Jahren wurde die Elektrophorese weiterentwickelt, indem feste Phasen zur besseren Separation eingesetzt wurden. Mit der Zeit etablierten sich schließlich Hydrogele wie Agarose oder Polyacrylamid.

Die Entwicklung der Blotting-Verfahren baut geschichtlich auf den Erkenntnissen der Elektrophorese-Forschung auf: Dem Forscher Edwin Southern gelang es im Jahr 1975, eine Blotting-Technik für DNA zu entwickeln. Diese Technik wurde nach ihrem Urheber als „Southern Blot“ bezeichnet. In Anlehnung an diese Übertragungstechnik wurden in den Folgejahren weitere „Blots“ entwickelt, etwa der „Northern Blot“ für die RNA-Analyse oder der „Western Blot“ für die Proteinanalyse. Diese Blotting-Verfahren werden heute in Kombination mit der Gelelektrophorese genutzt.

Je nach Zielsetzung der Analyse lassen sich unterschiedliche Gels verwenden. Weit verbreitet ist vor allem die Gelelektrophorese auf Basis von Agarose oder Polyacrylamid:

• Agarose: Agarosegel zeichnet sich durch eine großporige Struktur aus und eignet sich damit hervorragend für die Trennung von Nukleinsäuren. Dabei gilt: Je höher die Agarose konzentriert ist, desto engmaschiger ist die Matrix. So weist ein einprozentiges Gel etwa eine Porengröße von 150 nm auf, während ein 0,16-prozentiges Gel 500 nm große Poren hat. Um ein charakteristisches, sortiertes Bandenmuster zu erzeugen, wird das Gel üblicherweise mit einem DNA-bindenden Farbstoff versehen.
• Polyacrylamid: Gele auf Polyacrylamid-Basis zeichnen sich im Vergleich zu Agarose-Gelen durch eine deutlich engmaschigere Struktur mit Porengrößen zwischen 3 und 6 nm aus, auch hier variiert die Porengröße je nach Acrylamid-Konzentration. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) eignet sich für Proteine mit Molmassen zwischen 1 und 500 kDa. Dabei haben sich verschiedene Varianten etabliert, von denen die SDS-PAGE zu den etablierten gehört. Dabei wird zusätzlich Natriumdodecylsulfat (SDS) hinzugefügt, wodurch die Eigenladung von Proteinen überdeckt wird und eine Linearisierung der zuvor gefalteten Proteine erreicht wird.

Eine der wichtigsten Voraussetzungen für die Elektrophorese besteht darin, dass die elektrophoretische Mobilität der zu trennenden Teilchen unterschiedlich ist. Die elektrophoretische Mobilität ist ein Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit eines Teilchens im Gel und wird durch verschiedene physikalische Einflussfaktoren bestimmt. Dazu gehören in der Theorie unter anderem die Stärke des elektrischen Felds, die Größe des Teilchens und die Viskosität des Gels. In der Praxis kommen weitere Einflussfaktoren wie der dissipative Effekt oder der Dissoziationsgrad des Elektrolyten hinzu. 

Wenn eine unterschiedliche elektrophoretische Mobilität der zu trennenden Teilchen gegeben ist, stellt sich bei der Gelelektrophorese eine charakteristische, größenabhängige Sortierung der Moleküle ein. Im nächsten Schritt – dem Blotting – geht es nun darum, diese Sortierung auf eine Membran zu übertragen. Dazu wird das zu untersuchende Material auf einen Filter aus PVDF, Nitrozellulose oder Nylon übertragen und dort fixiert. Diese Vorgehensweise erlaubt es dem Anwender, das gewünschte Molekül durch Hinzufügen eines Antikörpers oder einer radioaktiv markierten Sonde zu identifizieren.

Wie bei der Elektrophorese existieren auch beim Blotting verschiedene Varianten, die sich für unterschiedliche Anwendungsfälle eignen. Zu den am meisten verbreiteten Verfahren der Proteinanalytik gehört der Western Blot, der sich für den qualitativen und semi-quantitativen Nachweis von Proteinen eignet. Die Methode sieht vor, dass eine Membran anodenseitig auf das Elektrophorese-Gel gelegt und beidseitig mit benässten Filterpapieren belegt wird. Durch das erneute Anlegen eines elektrischen Felds erfolgt der Transfer der Proteine auf die Matrix, ohne dass dabei das Muster der elektrophoretischen Auftrennung verlorengeht. Das an den Proteinen angelagerte Natriumdodecylsulfat (SDS) kann nun ausgewaschen werden.

Bei der anschließenden Proteindetektion erlaubt die temporäre Färbung aller Proteine eine Identifizierung bestimmter Proteine sowie eine semi-quantitative Abschätzung der Proteinmenge.

Anwendungsgebiete für Elektrophorese und Blotting

Die Verfahrenskombination aus Elektrophorese und Blotting hat sich in weiten Bereichen der Pharmazie, der medizinischen Diagnostik sowie der Biochemie fest etabliert und gehört dort zu den meistverwendeten Analyseverfahren für Nukleinsäuren und Proteine. Die Kombination aus Gelelektrophorese und Western Blot stellt beispielsweise ein bewährtes Verfahren für den Nachweis diagnostisch relevanter Proteine dar, beispielsweise bei der Identifizierung von Antikörpern im Blutserum beim HIV-Test oder bei der Suche nach krankheitsrelevanten Proteinen in der Pharmazie. 

In der modernen Laborpraxis lässt sich der Verfahrensablauf von Elektrophorese und Blotting heute mithilfe modularer Systemlösungen effizient und zuverlässig gestalten. So bietet Analytik Jena mit dem Biometra Eco-Line Elektrophorese-Gerät beispielsweise ein System an, das die Proteinanalytik mit PAGE-Elektrophorese durch ein modulares Tanksystem und High-tech Dichtungsmaterial im Gelgießstand für den täglichen Gebrauch optimiert. Für das schnelle und homogene Blotting von Proteinen und Nukleinsäuren dienen Geräte wie der Biometra Fastblot, der die Transferzeit auf ein Minimum verkürzt und eine reproduzierbare, qualitative und quantitative Protein-Analytik möglich macht.