Qualität von Impfstoffen: Gesamtproteingehalt über die TN-Analytik bestimmen

Impfstoffqualität: Wie Sie den Gesamtproteingehalt über den TN-Gehalt nachweisen

TN steht für den Gesamtstickstoff. Der Summenparameter ist einfach zu messen und erlaubt sichere und zuverlässige Rückschlüsse auf den Gesamtproteingehalt in einer pharmazeutischen wässrigen Lösung. Der Gesamtproteingehalt ist ein wichtiger Qualitätsparameter in der pharmazeutischen Impfstoffproduktion. Wie Sie den Gesamtproteingehalt über die TN-Messung schnell und einfach bestimmen, verrät dieser Beitrag.

Impfstoffe, auch Vakzine genannt, müssen während der Produktion regelmäßig auf ihren Antikörpergehalt getestet werden. Typischerweise wird dazu die Konzentration der abgeschwächten oder devitalisierten Viren oder Bakterien gemessen. Da diese Antikörper aus Proteinen bestehen, hat sich die analytische Quantifizierung über den Gesamtproteingehalt als Standardparameter etabliert. Für dies Bestimmung listen die Pharmakopöen eine Reihe von passenden Methoden, darunter verschiedene UV/Vis-Verfahren sowie zwei Messmethoden für den Gesamtstickstoff. Eine davon ist die katalytische Verbrennungsmethode, um die es hier gehen soll. Bei der Herstellung von Impfstoffen zur Allergiebehandlung können mit dieser TN-Testmethode auch Rohstoffe wie etwa Pollenlyophilisate, Zwischenprodukte oder unterschiedliche Darreichungsformen wie etwa Desensibilisierungsimpfstoffe, Pricktest-Lösungen oder sublinguale Medikamente analysiert werden.

Katalytische Verbrennungsmethode zur TN-Bestimmung

Die europäische Pharmakopöe (Pharm. Eur. Monograph 2.5.33, Method 7 B) beschreibt die katalytische Verbrennungsmethode als Hochtemperatur-Pyrolyse der Stickstoffverbindungen zu Stickstoffmonoxid (NO) in einer sauerstoffreichen Atmosphäre, gefolgt von der Quantifizierung durch einen Chemilumineszenzdetektor (CLD). Da der Stickstoffgehalt von Proteinen nur sehr geringfügig variiert, können durch Verwendung eines gut charakterisierten und verfügbaren Protein Referenzmaterials, wie z.B. BSA (Bovin Serum Albumin) die Gesamtstickstoffgehalte in Gesamtproteingehalte über einen Faktor umgerechnet werden. Der Proteingehalt ergibt sich aus dem Gesamtstickstoff multipliziert mit dem Faktor 6.25: C [Total Protein] = c [Total Nitrogen] x 6.25. 

Die in der europäischen Pharmakopöe beschriebene Methode ist nahezu identisch mit der Europäischen Norm DIN EN 12260. Diese Norm beschreibt ebenfalls eine katalytische Verbrennungsmethode mit anschließender Chemilumineszenzdetektion der entstandenen Stickstoffmonoxid-Moleküle für die TN_b-Bestimmung (gesamter gebundener Stickstoff), allerdings für die Untersuchung von Wasserproben aus der Umwelt. Insofern können TN_b-Analysatoren wie etwa die Geräte der multi N/C-Serie von Analytik Jena, die sehr verbreitet im Umweltsektor eingesetzt werden, auch effektiv für die Qualitätskontrolle der pharmazeutischen Impfstoffproduktion eingesetzt werden. Die Systeme benötigen jedoch einige Anpassungen, um den hohen Anforderungen der Pharma-Industrie in Bezug auf Datenintegrität- und Sicherheit entsprechen zu können.

Analytik Jena hat dazu eine spezielle multi N/C pharma-Serie auf den Markt gebracht, die den Normen und Standards im Pharma-Bereich vollumfänglich Rechnung trägt.

Beispielmessung: TN in Impfstoffproben und Harnstoff-Kontrollstandards gegen eine BSA-Kalibration

Für die Beispielmessung wurden fünf Harnstoff-TN-Standards, ein BSA-Kontrollstandard sowie drei Impfstoffproben aus je drei unabhängigen Abfüllungen vermessen. Die Proben wurden nach der Konditionierung bei Raumtemperatur mit einer Mikropipette direkt in 2-ml-Probenfläschchen pipettiert und mit Septumdeckeln verschlossen. Probenaliquoten von 75 μl wurden daraufhin mit Hilfe der Mikroliterspritze des Autosamplers in den Verbrennungsofen des multi N/C 2100S pharma injiziert. Als Autosampler kam der AS 60 von Analytik Jena zum Einsatz, der über eine automatische, magnetische Rührfunktion sowie eine Spülstation für die Injektionsspritze verfügt. Speziell bei partikelhaltigen Proben unterstützt die Rührfunktion die Probenhomogenisierung und ermöglicht dadurch die reproduzierbare Messung repräsentativer Probenaliquote. Die intensive Reinigung der Dosierspritze über die Spülstation verhindert nachhaltig vor allem bei proteinhaltigen Lösungen die Verschleppung von Probe in die nächste Messung.

In einer reinen Sauerstoffatmosphäre wurden dann mit Hilfe der katalytischen Hochtemperaturverbrennung bei 800 °C alle Stickstoffverbindungen in Stickstoffmonoxid (NO) umgewandelt. Der multi N/C 2100S pharma nutzt für die vollständige Probenoxidation einen Platinkatalysator. Das NO wurde anschließend quantitativ mit Hilfe eines CLD-Detektors nachgewiesen.

Der Analysator wurde mit einer Mehrpunktkalibrierung von 5 bis 60 mg/l für TN unter Verwendung einer BSA-Protein-Standardlösung (Referenzprotein: Bovine Serum Albumin) kalibriert. Zur Berechnung der Proteinkonzentration aus der gemessenen N-Konzentration wurde der Standardumrechnungsfaktor von 6,25 angewendet.

Die Messung der Standards und der Proben zeigen eine sehr gute Wiederholbarkeit und eine sehr geringe Standardabweichung RSD bei kurzen Messzeiten von 3 – 4 Minuten je Injektion. Die Messkurven weisen weder Abweichungen zwischen den Wiederholmessungen noch signifikante Peak-Tailing-Effekte auf.   

Ausführliche Informationen zur Methode erhalten Sie in unserer dazugehörigenApplication Note.